语音版脊髓损伤后结肠神经肌肉部分的解

语音为翻译者对整篇文章的概括

脊髓损伤（SCI）后，结直肠传输时间显著缩短，但是尚不完全清楚SCI后结肠的改变。目前认为其发病机制是支配结肠的腰骶神经环路的下行传导通路的缺失。然而，在其他病理生理模型中，结肠壁内神经系统/平滑肌接头处在炎症反应中的重构被认为是导致结肠运动障碍的另一个因素。我们探究了胸部高位（T3）SCI大鼠模型神经肌肉接头的改变。伤后1天至3周，损伤组和年龄匹配的对照组均先进行在体实验，再进行组织学评价。T3-SCI大鼠结肠近端和远端结肠自发收缩明显减少。结肠近端和远端组织学评价显示结肠粘膜隐窝深度和宽度明显减少。采用qRT-PCR法检测肠道炎症标志物。具体而言，Icam1,Ccl(MCP-1)和Ccl3(MIP-1α)mRNA在T3-SCI后急剧升高。T3-SCI大鼠结肠平滑肌厚度和胶原含量显著增加。使用泛神经元标记物HuC/D对结肠横切片进行免疫组化处理，结果显示结肠壁内神经元密度显著降低，在损伤后3周表达更明显。我们的数据表明，SCI后肠神经肌肉出现炎症和重塑。这些形态变化可能引起结肠运动减少，出现这种减弱可能是由结肠的神经肌肉控制受到破坏所致。

结肠动力；肌间神经丛；神经源性肠道；平滑肌；肌层

脊髓损伤（SCI）极大地改变了个体多个器官系统的生理状况。除了运动和感觉障碍外，心血管系统和内脏器官的自主神经系统调节也严重受损。肠功能障碍，通常指神经源性肠道功能障碍，是与SCI最相关和临床上公认的并发症之一，表现为结肠转运减弱、便秘、排空协同失调和溢出性失禁。此外，肠功能障碍对躯体和心理造成双重挑战，降低生活质量。对SCI人群调查发现，他们认为结直肠、膀胱和性功能障碍的影响最为严重，并且认为肠功能恢复要优先于行走能力的恢复。尽管如此，肠功能障碍的临床前研究仍然非常缺乏。

肠功能障碍是由SCI后多种因素导致。重点通常认为是躯体与自主神经环路的脊髓上调节受损所致，并且常常被归类成SCI后储存和排泄方面的缺陷。然而，包括结肠在内的胃肠道的独特之处在于它具有自己广泛的内源性神经系统，又被称之为肠壁内神经系统（ENS）。

ENS具有准自主调节（quasi-autonomously）功能，为分泌、推动结肠内容物和结肠节段性运动提供了必要的局部反射性运动程序。结肠顺应性和神经肌肉接头的推进能力最终取决于肠壁的肌肉特性。

炎症性肠病（IBD）的实验模型已经证实了神经肌肉部分的病理生理改变。有人提出，反复对结肠进行炎症性损伤会引起肌壁增厚并且逐渐纤维化，继而影响顺应性和推进能力。实验诱导结肠炎后有明显的形态学改变，对诱导后6天或1天进行评估，发现肌层增厚，并且整个肌膜的胶原沉积增加。同样观察肠肌有改变，这可以解释在炎症发作消退后在很长一段时间内仍然存在运动障碍。

由于SCI引起的深刻而持久的生理变化，必须谨慎推断IBD的并行机制变化。一篇关于SCI人群结肠炎症和纤维化的半定量研究指出，纵向肌层中胶原的增加以及肠肌神经元密度整体减少。

验证SCI动物模型的适用性并观察神经肌肉的急性和长期生理变化，对SCI人群的治疗策略的设计很有帮助。在本研究中，我们使用自建的T3水平SCI大鼠模型来验证我们的假设，即T3水平SCI可引起病理生理组织重塑和结肠收缩性降低。

我们探讨了以下假设：

1、T3-SCI模型导致局部结肠平滑肌收缩减弱；

、T3-SCI引起肌肉区的改变，类似于结肠炎后的变化；

3、T3-SCI引起结肠腔的病理生理改变；

4、T3-SCI导致结肠胶原浸润增加；

5、T3-SCI导致肠神经元的丢失。

所有的程序都遵循了国家卫生研究院的指导方针，并被宾夕法尼亚州立大学赫尔歇医学院的动物护理和使用委员会批准。选取≥8周龄雄性Wistar大鼠（n=，Hsd：WI，Stock，Harlan，Indianapolis，IN，USA），实验开始前称重，纳入体重为–00g的大鼠，一笼养两只老鼠。保持室温1-4℃，1:1小时的白天-黑夜循环，自由进食物和水。

大鼠随机分为SCI组和手术对照组，两组随后被随机划分至3天（共0只）和3周（共0只）术后研究组。为了研究结肠炎症，产生了另外4个组：T3-SCI或手术对照组的术后1天（共16只）和7天（共16只），以及一组单独的术后3天（总共16只）和3周（总共16只）的T3-SCI或手术对照组。在手术前，大鼠用异氟醚（isoflurane）（-3%，1L/minO）进行深度麻醉。必须满足无反射（无睑反射），并在反馈控制的加热垫上保持35.5-37.5°C的体温，连续监测直肠温度（TCATLV,PhysitempInstruments,Clifton,NewJersey）。

如前所述，所有动物双眼均被施用眼药膏,丁丙诺啡SR（1mg/kg，s.c.，ReckittBenckiserPharmaceuticalsInc.，Richmond，VA，USA）以减轻术后疼痛，以及在任何手术操作之前使用抗生素（恩诺沙星，10mg/mL浓度，1ml/kgsc，Bayer，ShawneeMission，KS，USA）以减少术后感染。一旦达到深层麻醉层面，剃掉T1-T3上皮肤毛发并且三次交替应用氯己定(醋酸氯己定，FortDodgeAnimalHealth，FortDodge，IA，USA)和乙醇交替清洁。沿中线切开手术部位3～4mm，清除棘突下面所有的肌肉组织。使用尖头咬骨钳，通过T棘突的椎板切除术暴露T3脊髓。

将大鼠置于InfiniteHorizon控制的冲击装置（PrecisionSystemsandInstrumentation，LLC，Lexington，KY，USA）中并夹紧T1和T3棘突。安全放置后，将一个kDyn快速的力（停留15秒时间）施加于髓核和硬脑膜上。除了椎板切除术不应用冲击装置以外，对照组动物的手术程序与脊髓损伤组相同。手术完成后，用Vicryl缝合线将覆盖在手术部位的肌肉组织在解剖层缝合，用9mm伤口夹闭合皮肤。术后5-7天，在必要时取走伤口夹。给动物使用加热的补充液(皮下注射乳酸林格氏溶液)并置于37℃恒温的孵化室中，直到麻醉效果减退。手术结束后，将动物单个饲养在装满玉米芯的动物饲养笼中，笼置于加热装置(GaymarT-pump，Stryker，Kalamazoo，MI，USA)上，以保持温暖环境(~5°C)。由于大鼠处于单个笼子，每个笼中放置直径为8cm塑料管段使环境丰富。接受T3-SCI的大鼠术后连续5天，每天两次皮下注射补充液（5-10cc乳酸林格氏溶液），每天一次注射抗生素（恩诺沙星，10mg/kg）。对T3-SCI大鼠进行每天至少两次的膀胱压迫直到恢复自发性排尿。每天对对照组大鼠进行腹侧检查，无需人工压迫膀胱。由于T3-SCI后运动能力降低，将食物库置于头部水平以便于大鼠进食。每天测量所有T3-SCI大鼠摄取的食物（可被测量出来），从而证实其可获得食物。每天测量所有动物的体重和食物摄入量作为健康指数。在实验和安乐死之前，动物禁食一晚。

在初次手术后3天或3周后，在用硫代巴比妥（Inactin；Sigma，St.Louis，MO；75-mg/kgiv）再次深度麻醉前，动物将禁食一晚，自由饮水。硫代巴比妥不影响长期心血管或胃肠自主神经功能。将动物置于反馈控制的温热垫(TCATLV，PhysitempInstruments，Clifton，NewJersey)上，并在实验期间保持在37±1℃。

一旦为生理实验完全麻醉后，通过腹侧颈部1-cm中线切口对下颌骨向胸骨切口方向进行大鼠气管插管。气管插管保持呼吸道畅通，必要时便于清除呼吸道分泌物。在中线使用钝性解剖分离下面的带状肌肉以暴露气管。分离暴露的气管与食管下段，在气管和食管之间放置3-0ethilon缝线环并打结。气管腹侧开口，在甲状腺尾侧气管的两个软骨环之间的膜上开一个小切口。将一小段聚乙烯管（PE-70，长5mm，一端倾斜）插入气管内，并用绑扎固定。将带状肌恢复到适当的解剖位置，用3-0ethilon缝线将上层皮肤固定在气管周围。

压力传感器由两个3.5FMikroToIP?导管压力传感器（MillarSPR-54，MillarInstruments;Houston，TX）组成，放入结肠近端和远端。对于近端结肠，采用中线剖腹手术定位盲肠。一旦分离，紧接在盲肠远端做一个小切口，插入约cm的传感器。使用手术胶固定导管并密封切口。对于远端结肠，将探针润滑并引入直肠和远端结肠，使得传感器的尖端位于距直肠约4cm处。由于对结肠的过度操纵可引起其生理学的改变，所以将传感器放置在结肠缺乏粪便颗粒的区域(≥1cm）以尽量减少实验者对组织的处理。只有在绝对必要的情况下，才会转移结肠远端的粪便颗粒。信号经MikroTip?导管后会被放大，在计算机上可利用SciWorksDataWave软件（DataWaveTechnologies;Loveland,CO）来连续记录，稳定1小时后，记录近端和远端结肠10分钟结肠反应的基线。

在体内生理实验结束时，深度麻醉的大鼠接受气胸手术，并切开左心室进行放血。分离并收集每只大鼠的结肠组织（近端和远端）。组织样本采用以下两种方式保存：1、新鲜组织样品放置在铝箔中，然后立即冷冻在液氮或冰箱中。、对需进行HE、MassonTrichrome染色或免疫组织化学处理的组织，将样品固定在4%多聚甲醛中4小时，再转移到70%乙醇中4小时，然后石蜡包埋。

在肠组织收集完成时，除去包含脊髓损伤水平的椎骨，并将整个椎骨组织样品在含有4％多聚甲醛的冷藏磷酸盐缓冲液（PBS）中过夜固定。3-7天后，移除单个椎骨的背面，将脊髓提取以再次浸入含有4％多聚甲醛和30％蔗糖的新鲜冷藏PBS中用于低温切片。

所有被指定进行qRT-PCR定量实验的大鼠(每种手术情况8只*术后4个时间点)均在未进行生理实验的情况下被安乐死。为了更多探究炎症反应随时间的变化图，将大鼠分成术后1天、3天、7天和3周组。将深度麻醉大鼠在同一时期（09:00～10:00）通过割颈放血。分离每只动物的结肠组织（仅近端）并置于铝箔中，然后立即快速冷冻在液氮中。

为了对T3-SCI病变范围的脊髓进行组织学染色，将脊髓组织冷冻切片（40μm厚），固定在明胶包被的载玻片上。为了与对照组大鼠比较脊髓病变的严重程度，使用luxolfastblue（LFB）染色来展示有髓纤维。将LFB染色的载玻片在ZeissAxioscope光学显微镜和AxiocamCCD相机上进行数字成像，导入AdobePhotoshop并对比度进行数字调整，以便能够一致地鉴定LFB染色（即备用）的白质。对于单个图像，概述组织切片的边界以确定横截面积。产生单独的阈值直方图，并选择对应于以上背景的LFB染色的像素。定量上述像素并用每单位横截面积表示。确定病变中心为最低比例的LFB染色组织的切片。T3病变中心与颈膨大距离较近，因此无法准确确定损伤前端组织的脊髓横截面积（即受损组织延伸至颈膨大处）。因此，基于标准化处理原则，有必要确定在大鼠T3处取相同大小的完整脊髓横截面积。然后，损伤组织中LFB染色的髓鞘按完整组织所预测的脊髓损伤总横截面积的百分比来表达。

用多聚甲醛固定组织标本进行全结肠组织学和组织化学评价。将两到三个不连续的样本组织置于相同的包埋盒中，在Tissue-TekVIP处理器中自动处理，并使用Tissue-TekTEC包埋站（SakuraFinetekUSA，Torrance，CA）包埋石蜡。将整块样品以6μm连续横切，并将多组非相邻的连续切片安装在Plus载玻片(ThermoFisherScientific,Pittsburgh,PA）上，并进行H＆E染色或组织化学染色。所有载玻片都标有非识别数字代码，以防止观察者在分析过程中产生偏差。

在0x放大倍数下，随机选取三个不同的区域，捕获并分析结肠近端和远端的肌层图像。使用Zeiss图像采集软件ZEN，记录整个组织区域和仅记录肌层区域。通过Masson‘sTrichrome组织化学染色定量估计肌层的胶原蛋白含量，以区分近端和远端结肠肌层内的胶原纤维（蓝色）和肌纤维（红色）。

同样使用的ZeissZen软件以定量分析结肠H＆E切片结肠隐窝深度和宽度。在0x放大倍数下，选取最少三个，随机选择的区域图像。为了保持分析的一致性，仅选择自然产生的粘膜下褶皱的隐窝。此外，由对治疗不知情的美国兽医病理学家学院的医生检查结肠H＆E切片的子集，并且验证观察者之间结果的一致性。通过测量隐窝深度和宽度并计算隐窝深度：宽度比来分析组织切片。

肠壁内神经元免疫组织化学染色采用相邻的6μm节段石蜡包埋结的肠组织；取样品并在10mM柠檬酸钠缓冲液中进行热介导的抗原修复0分钟。通过在UltraVisionProteinBlock（TAPBQ;ThermoScientific）中室温孵育5分钟来减少非特异性抗体结合。

4℃下，将切片在包含抗人神经元蛋白C和D抗体（小鼠单克隆抗HuC/D；稀释度1：00;LifeTechnologies，A）和％的牛血清白蛋白（BSA）混合物中首次孵化4小时。HUC/D通常用作肠道泛神经元标记物。孵化后，将组织在洗涤缓冲液中洗涤3次，每次分钟，然后室温下再次在抗原混合物中孵化小时（抗小鼠IgG-过氧化物酶抗体;稀释度1：;Sigma-Aldrich，A和％BSA）。使用二氨基苯哒嗪（DAB）定位标记，并用苏木精复染切片。

使用先前描述的方案确定每个肠神经节区域的神经元数量，使用ImageJ软件（NIH，Bethesda，MD，USA）分析来自每个组织切片的HuC/D阳性神经节的图像。个别神经节在完整的肌间神经丛内可表现出有变化的横截面大小，这可能反映出神经节出现在截面平面内的区域。虽然神经元损失可以预测到神经节面积的减少，但横截面积的差异被认为是变异最大的来源。出于标准化原则，通过测量神经节总面积（以μm计算），数该神经节内HuC/D阳性神经元的数目，计算出每单位面积的神经元数目来定量研究神经元数量。

定量逆转录酶PCR（qRT-PCR）用于量化在指定时间点存在的炎症介质的水平。分析来自近端结肠的组织切片的细胞间粘附分子-1（Icam1），单核细胞趋化蛋白（Ccl）和巨噬细胞炎症蛋白-1（Ccl3）。根据大鼠基因组命名委员会指南（

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