贝克曼DXC系列生化仪的参数设置

四年前写过一篇帖子”DXC系列的时序图及理解”，从DXC系列的时序图介绍了试剂和样本的注入时间以及读点，当初没觉得有什么多大的问题，仅仅是因为网上提问的人较多，写出来或者说翻译出来罢了。但最近在群里，特别是两个月前在外省的一次维修让我印象深刻，三年的DXC，开放通道几乎都是采用的双试剂，而试剂参数竟然全部是样本加入前仪器自动混匀成单试剂使用。院方一直在抱怨仪器结果不好，整台机器几乎当成急诊机用，只使用MC单元。由于并不是去维修这台生化，再说当时试剂厂家和仪器经销商都在场，只是看了一眼参数界面和曲线后明白了原因。回来后觉得有必要详细说明一下，赶上培训没倒出时间，前几天才开始写这篇帖子。贝克曼DXC系列是从LX系列和CX系列升级而来，其速度慢结果准是共识，当然耗材和试剂消耗成本也大。1、先从其特有的试剂盒说起：图1DXC试剂盒图片这是DXC的专用试剂盒，一个试剂盒分为三个腔，1是A腔，2是B腔，3是C腔。每个腔都有自己的最大最小容量，分别是：A腔最大ml，最小6mlB腔最大18ml，最小1mlC腔最大4ml，最小0.3ml超过最大或最小容量，液面探测都将无法准确的探测到，可能会报告缺少试剂等情况。由于是三个腔，可以装入三种不同的试剂，所以DXC本身可以支持三试剂测试项目。试剂盒的三个腔，可以任意指定其中的一个腔作为第一试剂，也就是R1，当然也就可以指定另外两个腔的一个为R2，或者R3。虽然习惯上我们把最大的A腔放入R1，较小的B腔装入R2，最小的C腔装入R3。除了可以采用三试剂测试项目，DXC采用三腔试剂盒的目的还有一个原因是，有些试剂的成分有些特殊，提前混匀会造成不稳定甚至失效的情况，所以分腔装入，上机前人工混匀到一个腔，或者由机器在添加试剂时自动加入混匀。例如有些试剂的R1成分中，用于消除干扰的某些成分不能长期与缓冲液等物质共存很长时间，一般也就能稳定几天或几个小时。所以在生产的时候，将缓冲液为主的成分放入A腔，将消除干扰的成分放入B腔，启动反应的物质放入C腔。上机前人工将B腔的物质按照比例加入A腔混匀后再上机，或者在设置参数的时候，将A腔和B腔的物质提前按照比例加入，然后再加入样本，之后再加入R3启动反应。在过去很多DXC的原厂试剂里，说明书里都会指出上机前的试剂准备，现在很少有这样的试剂。但这种方式可以解决很多参数上的双试剂比例问题。我们最常用的三试剂测试项目是糖化血红蛋白，第一试剂是溶血剂，第二试剂是乳胶和缓冲液，第三试剂是单抗等物质。除了日立系列和ADVIA的老版本机型支持四种试剂外，DXC的三试剂腔就是为数不多的支持两种试剂以上的机型之一。DXC系列是R+S+R方式，也就是先加入试剂后加入样本。在样本加入前后均可以选择加入一种或两种试剂，如果样本加入后不再加入试剂，实际上就是单试剂反应，无论样本加入前加入了多少种试剂都提前由机器混匀成单试剂了。下图是采用三试剂的项目反应曲线示意图：图2三试剂反应曲线示意图“-T1”R1加入点；“-T2/0”是R2或者样本的加入点。如果加入的R2，就是提前将R1R2混匀成单试剂，称为“-T2”，如果加入的样本，那么就是“0”，所有的生化机型都是在样本加入的那一刻开始计时的，样本加入之前的，要么是负数要么是0；“0/T1”，如果“-T2/0”点加入的是R2，那么这一点就是加入样本“0”，如果“-T2/0”点加入的是样本，那么这一点就是加入R2“T2”，相信都能理解；“T2”是第三种试剂的加入点。由此可以看出，如果三个腔都有试剂都参与反应的话，在反应曲线上会出现四个加入点：“-T1，-T2/0，0/T1，T2”。分别对应R1，R2/S，S/R2，R3。那么三试剂的加入就会有以下几种可能：采用R1+R2+R3+S方式：这也就是单试剂方式，“-T1”加入R1，“-T2/0”加入R2，“0/T1”加入R3，“T2”加入S，那么在读点的时候，A4区域是反应读点区，A3区域是试剂空白区，由于提前混匀成单试剂了，所以就不存在R1+S的空白区域。采用R1+R2+S+R3方式：“-T1”加入R1，“-T2/0”加入R2，“0/T1”加入S，“T2”加入R3，那么在读点的时候，A4区域是反应读点区，A3区域是试剂加样本的空白区，因为提前将R1和R2混合了剂了。采用R1+S+R2+R3方式：“-T1”加入R1，“-T2/0”加入S，“0/T1”加入R2，“T2”加入R2，那么在读点的时候，A4区域是第二反应读点区，A3区域是第一反应读点区，A2是试剂加样本的空白区。注意这里的用词，第一第二反应读点区，后面说到参数设置时会遇到。采用这种方式，会出现一个空白区，两个反应区，有些类似日立的双项目测试，比如先测试AST，测试结束后并不是马上清洗反应杯，而是加入第三种试剂继续反应，用来测定ALT。但由于没有相应的试剂盒，所以成了摆设。由于我们常用的是双试剂方式，那么就会有以下几种可能：我们先把图2简化一下：

图3双试剂反应曲线示意图采用R1+R2+S方式：这也是单试剂方式，“-T1”加入R1，“0”加入R2，“T1”加入S，那么在读点的时候，A3区域是反应读点区，A2区域是试剂空白区，由于提前混匀成单试剂了，所以就不存在R1+S的空白区域。采用R1+S+R2方式：这也是我们最常用的最想用的方式，“-T1”加入R1，“0”加入S，“T1”加入R2，那么在读点的时候，A3区域是反应读点区，A2区域是试剂样本空白区。之所以这么啰嗦的罗列了5种可能，目的是让大家清楚的知道这些可能存在的组合对将来的参数设置的意义，要清楚的知道你设置的参数要达到一个什么反应效果。2、DXC的样本和试剂加入量规则：DXC的总反应量在-ul之间，如果没有R2和R3，那么R1的添加量不能少于ul。样本加入量范围：3-40ulR1加入量范围：-ulR2加入量范围：6-75ulR3加入量范围：6-75ul3、DXC的样本和试剂加入时间规则：DXC的反应盘一共有个反应杯，每个读点的时间是8秒，在8秒钟内，反应盘旋转两圈半，也就是说每个读点周期内，相应的反应杯有两个点。下图就是它的实际反应曲线，可以清晰的看到两个点叠加或紧密上下排列。图4反应曲线图片由图4可以看出，每隔8秒有两个上下或重叠的点。还可以看出R1和R2都是提前加入的，由于R1加入时间要早于R2，所以R2之前的时间就不计算了，整个读点时间从-.5秒开始，在-秒加入R2。在-64至0秒读取试剂空白吸光度，也就是绿色线条区域。在0秒加入样本启动反应，在64至.7秒的区域读取反应吸光度，也就是反应读点区蓝色线条区域。那么根据这张图，我们也就知道了，DXC的读点规则并不是按照点来度，也就是按照反应盘旋转的圈数来读，而是用时间进行标记。以样本加入为0秒，之前的加入试剂算作负数，之后加入的试剂算作正数。图4的例子是双试剂混成单试剂，样本加入之后没有再加入试剂。在DXC的规则当中，R1加入默认为-秒，也就是样本加入之前3分钟，但R1的加入时间人工无法修改，完全是自动调节，调节的范围是-或-。R2的加入默认时间也是-，但如果R2是-的时候，R1自动成为-，因为仪器就两根试剂针，无论如何也无法同时为同一个反应杯加入两种试剂，所以遇到这种情况，R1自然再提前加入。所以，这是一个主要的要点。R2的加入除了默认的-秒以外，还可以选择时间加入，但只能在9至秒加入，也就是说，除了默认的-秒外，只能在样本加入后的9秒至秒加入。这是第二个注意的要点。如果整个参数只有两种试剂，R1和R2，那么R2只能在9-秒加入，而且仪器自动将其算作第三加入的试剂。这是第三个注意的要点。也就是说如果是三种试剂都用，那么R2可以默认为-秒加入，如果只用两种试剂，R2的加入时间只能是9至秒。这句话的出处在中应为的操作手册上明确注明，下面就是手册截图：图5中文操作手册对R2加入的注明图6英文操作手册对R2加入的注明DXC系列绝大多数试剂参数问题出现在这里，剩下的问题只有两个，一个是方法（检测方法和定标方法）问题，和读点的起止时间问题。而R3的加入可以在R2之后的8秒以后，也就是-秒，或者9至秒。也就是说如果三种试剂混合成单试剂，那么R1时间默认（无法修改），R2为-，R3就为-秒。如果R1和R2混合成单试剂，R3为反应启动试剂，那么R1时间默认（无法修改），R2为-秒，R3就应该是9至秒时间段内的一个时间点。如果只用两种试剂，那么R1时间默认（无法修改），R2的时间则是9至秒时间段内的一个时间点。具体在哪一个时间点，要根据试剂说明书上要求的反应孵育时间来进行计算，当然都要被8整除（商的结果有0.5秒的小数也可）。那么，在看懂了前面的说明之后，下面这张图，也就是我们经常引用的时序图也就能看明白了。还有一点要注意的是，一旦选择了第二第三试剂为None，也就是说只有R1，没有R2R3，那么一旦保存就无法修改，只能删除重新建立参数。图7时序图这张图也许有人看了半天会有歧义，这不奇怪，有歧义的地方应该看说明，但我们恰恰是没有看说明，仅仅是根据图来分析。这张图告诉我们，整个机器的反应时间最长竟然是惊人的秒，将近18分钟多。最少也得秒，将近15分钟多。差出的三分钟就是R2在样本加入之前和之后加入的时间差。其实，整体的反应时间更长，达到0秒，将近28分钟。下面我们在详细说说这张时序图：主试剂灌注也就是R1的加入3至6分钟，这个好像没有异议；样本加入为0秒也没有问题；而第二次注入试剂的时间却有很多歧义，原因是没有看到人家的时间标示里面的逗号。上面清楚的写着T=-,9-。也就是说，要么-秒加入，要么在9至秒时间段里的一个时间点。近10年前我第一次看到这张图的时候，立刻被这个逗号疑惑，赶紧翻看纸质的说明书，才明白逗号的原因。由于我们经常采用双试剂，所以对第三试剂加入的时间不怎么关心，虽然它与第二试剂加入的时间同样有一个逗号。T=-,9-。也就是说，要么-秒加入，要么在9至秒时间段里的一个时间点。反应空白读数时窗这句话和这个双向箭头也是引发歧义的一个方面，从-到秒都可以选择，前提是属于空白的区域，无论是试剂空白还是试剂样本空白都可以。反应读数时窗则是选择在启动反应后的阶段进行的时间选择。4、DXC的反应方法定义：任何生化仪器的反应方法只有两大类，就是终点法和速率法，不同仪器有自己的不同衍生方法，DXC系列也是如此。在参数设置界面里，ReactionType里有Endpoint1/2/3/4/5和Rate1/2/3/4/5十种选择。由于DXC可以支持三种试剂，也就是样本加入之后可以有两个反应区间，我们对应图2及R1+S+R2+R3的方式，解释这十种反应方法的定义如下：Endpoint1是指的一点终点法，第一反应区的吸光度值，也就是A3；Endpoint2是指的两点终点法，第一反应区的吸光度值减去空白吸光度值，也就是A3-A2；Endpoint3是指两点终点法，第一反应区的吸光度值减去空白吸光度值，也就是A3-A2，但这里的空白吸光度是经过样本体积和R1试剂体积修正过后的，空白吸光度要乘以一个系数，这个系数=（空白读数时的样本和试剂体积）/（反应读数时的样本和试剂总体积），这个方法也是最为精准的两点终点法；Endpoint4是指的两点终点法，第二反应区的吸光度值减去空白吸光度值。也就是A4-A2，这个很少用到；Endpoint5也是指的两点终点法，第二反应区的吸光度值减去第一反应区的吸光度值，也就是A4-A3，更是很少用到的。Rate1是指的速率法，也就是常见的速率法，第一反应区的吸光度每分钟变化，也就是A3；Rate2是指的双速率法，第一反应区的吸光度每分钟变化减去空白吸光度的每分钟变化，也就是△A3-△A2；Rate3是指的双速率法，第一反应区的吸光度每分钟变化减去空白吸光度的每分钟变化，也就是△A3-△A2，但这个空白吸光度值是经过样本体积和R1试剂体积修正过后的，空白吸光度要乘以一个系数，这个系数=（空白读数时的样本和试剂体积）/（反应读数时的样本和试剂总体积）；Rate4是指的双速率法，第二反应区的吸光度每分钟变化减去空白吸光度的每分钟变化，也就是△A4-△A2；Rate5是指的双速率法，第二反应区的吸光度每分钟变化减去第一反应区吸光度的每分钟变化，也就是△A4-△A3从上面我们看到，如果单纯采用单/双试剂，那么最适合的方法是Endpoint1和Endpoint3，还有Rate1和Rate3，虽然我们经常用的是用Endpoint2和Rate2取代Endpoint3和Rate3。5、DXC的定标方法定义：大多数生化仪都提供定标曲线的查看功能，但DXC没有提供，它只提供反应曲线的查看。所以在这里出现问题也是很多的，因为看到定标曲线，也就不知道自己选择的定标方法是否正确，对不知道怎么对的，错也不知道怎么错的。在参数界面里，MathModel的选择有Linear，MathModel1/2/3/8/9，DATMathModel和DoubleInflectionModel等8种，如果在MathModel里不选择定标方法，那么就必须在CalculationFactor里指定一个系数，也就是采用因数定标。各定标方法的定义大致如下：Linear是线性定标，一点线性定标也就是给出一个定标液的浓度值进行校准，默认直线通过原点。但这个默认往往不靠谱，所以一般都采用两点线性定标，除了给出一个浓度值的校准品外，还有给一个零浓度点的校准品，也就是去离子水。MathModel1是对数曲线定标，Log-Logit4PMathModel2也是对数曲线定标，Log-Logit5PMathModel3是指数曲线定标MathModel8也是对数曲线定标，Log-Logit5P的非标准形式MathModel9也是对数曲线定标，Log-Logit4P的扩展形式DATMathModel这个真不知道是什么，由于看不到定标曲线，所以连猜都猜不出来，可能指的是折线。DoubleInflectionModel这是双重转折模型，也就是样条曲线从上面来看，线性定标只有一种选择，那就是Linear，非线性定标常用的是MathModel1，MathModel2和DoubleInflectionModel。5、DXC的参数界面：一共三屏，用与其相近的LX20的界面替代表示：图8DXC参数屏幕第一屏图9DXC参数屏幕第二屏图10DXC参数屏幕第三屏先各个设置项目解释一下：第一屏Number是项目编号Chem是项目名称缩写ChemistryParameters是化学参数ReactionType是反应方式选择Units是单位选择Precision是数值精确方式的选择ReactionDirection是反应方向选择，Positive是正反应，Negative是负反应MathModel是定标方式的选择PrimaryWavelength/SecondaryWavelength是指主副波长，DXC不支持单波长CalculationFactor是计算系数，也就是定标因数NumberofCalibrators定标液数量CalibratorValues定标液的浓度值CalibrationTimeLimit定标时间间隔，1-小时，最常2周必须定标processingparameters工艺参数FirstInject/SecondInject/ThirdInject第一/第二/第三试剂Component试剂腔的选择，A、B、CDispenseVolume试剂分配的容量AddTime/InjecTime试剂分配时间SampleVolume样本容量BlankReadTimes空白读取时间，如果选择了Endpoint2/3/4或者Rate2/3/4.此处必须填写，双试剂选择样本加入之后，R2加入之前的时间段的起止时间，间隔是8秒的倍数，且能被8整除。单试剂选择R1加入之后，样本加入之前的时间段的起止时间。InitialReadTimes初始读点时间，这里指的是反应启动后的一个时间段的起止时间，目的是用来监测反应是否过度或前带监测。不填写的话，仪器会默认添加，添加的原则是：如果是单试剂，选择样本加入后的第一秒作为起始点，第九秒为结束点，如果是双试剂的话，选择R2加入后的第一个8秒作为起始点，以第二个8秒为结束点。其实知道了这个初始读点的性质，那么自己也可以添加起止时间了，也就是启动反应后的几个点，这样才有利于监测。ReactionReadTimes反应读点时间，也就是用来监测反应吸光度值的时间段内的起止时间。单试剂在样本加入之后，双时间在R2加入之后，都是正数。UsableResultRange可使用的结果范围，也就是结果的吸光度高低限制，如果超出这个限制范围，结果将被抑制，用OIR-HI和OIR-LO旗标提示。范围是0.-.ErrorDetectionLimits错误探测范围。ReagentBlank(AbsorbanceorRate)试剂空白（吸光度或速率变化）限制范围，如果超出这个范围，结果会被抑制报告BLABSHI或BLRATEHI或BLABSLO或BLRATELO。高低限制在-1.到2.之间，平均差在0.到2.之间选择输入。Reaction(AbsorbanceorRate)反应吸光度或速率变化限制范围，超过这个限制结果会被抑制，报告RXABSLO或RXABSHI。高低限制在-1.到2.之间，平均差在0.到2.之间选择输入。InitialRateHighandSubstrateDepletion初始速率高和底物耗尽监测，初始速率是指加入样本或试剂后的最初的反应速率不能超过一个数值，如果超过将被抑制，报告INTRATEHI，这也是初始读点时间的用法之一。在初始速率和反应读点的速率差值（也就是δ吸光度）超过一定的范围，会认为是底物耗尽，会给予HIGHABS提示。初始速率范围-99.99至99.99，德尔塔δ吸光度范围为0.-2.之间选择。对于负反应来说，初始速率是负值。MultipointSpans多点跨度，指各定标点之间的吸光度或速率的允许差值范围，用正负号表示两个校准点之间的反应方向，允许输入的范围是-1.到2.之间，如果此处不输入，则定标无法通过。那么图8告诉我们的信息是项目ALB白蛋白采用ENDPoint2方法，也就是两点终点法，正反应，双波长分别是/nm，定标方式采用线性一点定标。图9告诉我们的信息是单试剂，R1的容量是ul，样本容量是3ul，空白读点为-32和-16，反应读点为和，也就是两分半钟左右的时间，符合白蛋白反应速度快的特点。由于是采用的LX20的参数，所以上面没有初始反应时间，可以默认（不填写），也可以输入1和9。图10告诉我们的信息是没有做任何反应监测，全部数值放到最大。根据前面三张图，我们可以尝试描绘出反应曲线示意图：图11模拟ALB的反应曲线6、DXC的其它项目设置举例刚才举例是单试剂两点终点法的例子，按理说单试剂用两点终点法没有意义，但这个机型R1加入后孵育时间很长，所以R1的空白排除掉也可以。再举一个两点终点法的双试剂例子：CRE肌酐的参数举例图12CRE的参数第一屏图13CRE的参数第二屏图14CRE的参数第三屏双试剂，R2在秒加入，也就是接近5分钟的时候，符合R2加入后孵育五分钟的试剂说明书的要求，空白读点在和，在R2之前。反应读点在和，也就是R2加入后的5分钟，样本加入后的10分钟，符合试剂说明书的要求。由于是采用的LX20的参数，所以上面没有初始反应时间，可以默认（不填写），也可以输入和。据此模拟的反应曲线如下：图15模拟CRE反应曲线再举一个速率法的例子：谷草AST的例子图16AST参数的第一屏图17AST参数的第二屏图18AST参数的第三屏双试剂，R2在秒加入，符合试剂说明要求的孵育5分钟，负反应速率法，空白读点和，反应读点和，一共读取16个反应读点。这里的校准采用的是因数法，但试剂厂家也提示用户尽可能采用定标液定标。由于是采用的LX20的参数，所以上面没有初始反应时间，可以默认（不填写），也可以输入和。如果需要监测底物过剩时，要在InitialRateHighandSubstrateDepletion中进行设置。据此模拟的反应曲线大致如下：图19AST模拟反应曲线示意图7、DXC参数设置误区误区之一：R2是固定的-秒，这样其实是混成单试剂，不仅-秒是错误的，还延长了反应时间三分钟，更会造成稳定性和结果上的偏差，误认为是试剂不好。误区之二：故意把R2设为-秒，理由是这样可以加快反应速度，DXC太慢了。其实这样做更延长了反应速度。不知道什么原因，虽然DXC在说明书里明确说明双试剂的R2不能是-的秒，只能在样本加入之后，但却不报警提示，都这么稀里糊涂的设置上用了。误区之三，空白读点和反应读点时间重叠，或者都在启动反应之后。例如下面的这个例子：图20错误的读点时间举例这是一个单试剂的两点终点法测试项目，空白读点是和，反应读点是和，不仅都在启动反应之后，也就是样本加入之后，还相互重叠。试想一下，如果这个参数被使用，不仅空白读点毫无意义，反而会因为设置的错误造成结果的假性偏高或者偏低，甚至会出现负值。而正确的设置是空白读点应该在启动反应之前，本例中应该是样本加入之前的负数，比如-32和-16。反应读点不需要改变或者继续往后延迟到5分钟左右的时间位置上，比如和。误区之四，初始读点和反应读点重叠，这个最容易忽视，初始读点时间一定是启动反应后的几个点而已，绝对不能过多，也不能接近反应读点，更不能与反应读点重叠。误区之五，多点定标没有设置多点跨度限制，造成定标失败。如果不知道怎么设置，可以将值输入为最大值-1.或者2.，要根据反应方向设置。如果设置为0，肯定会报错定标不过的。误区之六，想起来再补充。

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