内容
1.前言：生物制品糖基化表征的重要性
2.糖蛋白表征用分析方法
2.1糖基化特性
2.1.1多糖的直接分析
2.1.2糖谱分析
2.1.3N-糖的异质性分析
2.1.4单糖的分析
2.2多糖分析用技术
2.2.1糖分离技术
2.2.2多糖检测技术
●衍生/标记方式和多糖的检测
●荧光检测
●MS检测
●异构形式和连接方式的分析
2.3分析中的生物信息学工具
3.展望
1生物制品糖基化表征的重要性
年PaulBerg首次将重组DNA技术应用到蛋白生产中进而诞生了重组蛋白，药物中便有了一个新的分支——重组治疗蛋白。年，第一个重组蛋白重组人胰岛素诞生。从此使用重组胰岛素代替动物来源的胰岛素成为糖尿病治疗的一个重大突破。很快，很多其他重组蛋白被应用到治疗一些由于体内内源性分子（如激素、酶和凝血因子）分泌缺陷型疾病。而这些重组蛋白中超过60%是糖基化蛋白。现已证明重组表达的治疗型糖蛋白的糖基化类型及水平对其疗效、半衰期、稳定性和安全性等均有影响。为保持批次间糖型一致性，需要稳定的生产工艺和有效的糖型表征。
糖基化是最常见的蛋白翻译后修饰。这一复杂过程发生在内质网和高尔基体上。通常将多糖分为两类：N-糖（糖通过一个N原子连接在Asn）和O-糖(糖通过O原子连接在Ser/Thr)上。因N-糖在调节生物药品的稳定性、功能和结构完整性上具有重要作用，因此本文主要介绍N-糖。
N-糖主要分为3类：高甘露糖型、复合糖型、杂合糖型。高甘露糖型只含有甘露糖（下图中M3/M5/M8）。复合糖型（图中A3/A2B/FA2G2S2/FA2G2Ga1）通常包括半乳糖、唾液酸、和核心岩藻糖基。杂合糖型通常是由高甘露糖型和复合糖型的组合。由于基质和酶（糖苷酶、多种糖基转移酶等）的不同，N-糖基化生物合成方式添加或移除：N-乙酰葡糖胺、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、岩藻糖、甘露糖和唾液酸等。
可用于生产糖蛋白的基因工程细胞有多种：细菌、植物细胞、昆虫细胞、酵母和哺乳细胞等。采用重组技术用于生产治疗性糖蛋白的细胞主要是哺乳动物细胞系，其中以CHO细胞、BHK细胞、SP2/0和NS0细胞等为主。哺乳动物细胞因其具备完整的类人体PTMs功能而被广泛用于表达治疗型蛋白。其中，CHO细胞系在工业化生产中的应用最为广泛，原因是它们具有悠久的监管记录、易于操作、可以在化学成分限定的培养基中悬浮生长、良好的安全使用记录等。然而，CHO细胞系的一个缺点就是表达的蛋白糖基化一致性较差，因为糖基化过程中涉及的多种酶，并且在培养过程中会随着培养环境不同而导致其活性会发生变化，这样就会产生不同的糖型结构，导致批次间差异大。而尤为重要的是这些糖型的变化对蛋白结构、稳定性、溶解性、清除性、活性甚至免疫源性都有重要的影响。
比如：
例一：缺失末端唾液酸残基的治疗型抗体在血液循环过程中会被快速清除，因为暴露出的半乳糖残基会与肝细胞的脱唾液酸受体相互作用。
例二：末端脱去唾液酸的治疗性抗体因提升了ADCC和CDC效应从而提高了抗炎症作用。
例三：治疗性抗体岩藻糖去除后，ADCC活性较高。
例四：甘露糖的改变可以影响药物的半衰期和导致非靶向性肝毒性。
重组蛋白的N-糖型受培养条件影响：营养水平、溶氧水平、PH、温度、高应激力、血清、微载体和培养基的添加物等。例如在生产过程中通过调整培养基中的锰、半乳糖和尿苷浓度可以控制N-糖的β1,4-半乳糖基化。此外，目前在重组糖蛋白的生产过程中几个重要的糖基化控制点已经被识别，如糖基化酶（半乳糖转移酶4）和转运蛋白。
近些年的研究已经证实在细胞糖工程学领域的可调控点：利用多种基因工程策略生产特异性或是均一性糖基化修饰。例如：敲除FUT8基因的CHO细胞系建立可确保生产完整的无岩藻化的治疗性抗体，具有高ADCC活性、稳定的质量和疗效。最近又有一个新的方法称作GlycoDelete，它通过缩短高尔基体内的N-糖基化路径来减少N-糖的复杂性。如此，可产生高的N-糖一致性，但是会失去一些重要的复杂糖型。此外，酵母细胞经过人源糖基化改造后可以提供一些类人糖基化的修饰，说明糖工程学还是有一个很好的发展前景。
生物仿制药的到来促使了生物制药市场的发展。未来近十年间，随着多种治疗性抗体的专利期满，生物仿制药市场将会更快发展。而生物仿制药是要与原研药在理化性能、功效、安全性等均保持一致，因此这种药物理化对比性的分析需求提升了对高效分析工具的需求。
就大幅度减少医疗保健成本方面来说，生物仿制药的到来对于患者和社保部门来说都会是一个很好的选择。预估从-年仿制药可以给美国节省$billion。在欧洲和亚洲，仿制药可以节省近40%。然而后续研究发现，开发和生产仿制药所需要的费用并不像预期所想那么低。
法规方面，EMA在年颁布了第一个仿制药审批指南。年又颁布了补充指南强调了报批途径。同年FDA针对美国市场也出台了相应法规。年12月EMA又出台了新的报批指南，于年7月正式开始实施。但是就治疗性重组蛋白的糖生物学方面，这些指南虽然强调其重要，但是没有给出具体的分析指南。例如，在欧洲药典中，对于促卵泡素的要求是只需要控制唾液酸比例，对其他具有免疫源性的糖型并没有要求。随着市场需求，仿制药相关法规也会越来越一致和清晰。
2糖蛋白表征用分析方法
EMA要求“抗体应该被完全表征”。抗体的表征包括：理化、免疫源性、生物学活性、纯度、宿主细胞残留和抗体浓度，这些与ICH要求一样。关于N-糖分析，EMA指南中表示需白癜风哪个医院治疗得好白癜风怎样能治好
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